Atlas de tradução de mRNA e decaimento para bactérias

Nature Microbiology volume 8, páginas 1123–1136 (2023) Cite este artigo

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A regulação da estabilidade do RNA mensageiro é fundamental para a expressão gênica programada em bactérias e é alcançada por uma miríade de mecanismos moleculares. Por sequenciamento em massa de intermediários de decaimento de mRNA monofosforilado 5' (5'P), mostramos que a degradação de mRNA cotraducional é conservada entre bactérias Gram-positivas e -negativas. Demonstramos que, em espécies com exonucleases 5'-3', a exoribonuclease RNase J rastreia o ribossomo para produzir uma impressão digital in vivo de um único nucleotídeo da posição 5' do ribossomo. Em outras espécies sem exonucleases 5'-3', o posicionamento dos ribossomos altera os locais de clivagem endonucleolítica. Usando nossa abordagem de sequenciamento de metadegradoma (5'P degradoma), caracterizamos intermediários de decaimento de mRNA 5'P em 96 espécies, incluindo Bacillus subtilis, Escherichia coli, Synechocystis spp. e Prevotella copri e identificar respostas de bloqueio de ribossomos em nível de códon e gene ao estresse e tratamento medicamentoso. Também aplicamos o sequenciamento 5'P a microbiomas clínicos e ambientais complexos e demonstramos que o sequenciamento de metadegradoma fornece caracterização pós-transcricional rápida e específica da espécie de respostas a drogas ou perturbações ambientais. Por fim, produzimos um atlas de degrado para 96 ​​espécies para permitir a análise dos mecanismos de degradação do RNA em bactérias. Nosso trabalho abre caminho para a aplicação do sequenciamento de metadegradoma na investigação da regulação pós-transcricional em espécies incultiváveis ​​e comunidades microbianas complexas.

A degradação e a tradução do RNA mensageiro (mRNA) estão intimamente ligadas, e as alterações na dinâmica dos ribossomos modulam diretamente a estabilidade do RNA mensageiro1,2,3,4. Em eucariotos, a síntese de proteínas e o decaimento do mRNA são conectados pela exonuclease 5'-3' Xrn1, que segue o último ribossomo de tradução produzindo uma impressão in vivo de sua posição5,6. A degradação do RNA em bactérias permite a adaptação a ambientes em mudança, mas nossa compreensão da degradação do RNA nas bactérias tem sido dificultada pela diversidade dos mecanismos de degradação do RNA. Acreditava-se que a degradação do RNA bacteriano iniciava via clivagem endonucleolítica seguida por degradação 3'-5'7,8,9,10. Embora a atividade exonucleolítica do RNA 5'-3' da RNase J em Bacillus subtilis11 e seus homólogos em outras espécies9 tenha sido relatada, e a eficiência traducional seja conhecida por modular a estabilidade do mRNA em bactérias3,12, não entendemos como a degradação cotraducional do mRNA molda a estrutura bacteriana degradoma ou se esse processo difere em espécies com maquinário de degradação de mRNA divergente.

Para entender melhor a regulação da biologia do RNA em bactérias, investigamos a degradação do mRNA em cepas bacterianas de referência e microbiomas complexos usando sequenciamento otimizado de intermediários de decaimento (degradoma) de mRNA 5' monofosforilado (5'P) (5PSeq). Nós exploramos o grau em que o 5'P que ocorre naturalmente reflete a dinâmica dos ribossomos in vivo e caracterizamos o degradoma 5'P em resposta ao estresse ambiental e ao tratamento medicamentoso em cepas de referência e culturas fecais complexas. Analisamos padrões de degradação de mRNA em 96 espécies cultiváveis ​​e não cultiváveis, incluindo o organismo modelo B. subtilis, e relatamos nossas descobertas aqui.

Analisamos o degradoma 5'P mRNA em espécies individuais e comunidades bacterianas complexas usando 5PSeq otimizado)5,13,14,15 (tabelas complementares 1 e 2 e métodos). Primeiro, investigamos o degradoma 5'P de quadros de leitura aberta (ORFs) em espécies com decaimento 5'-3'. B. subtilis codifica a exonuclease 5'-3' RNase J11. Embora a RNase J não seja homóloga ao XRN1 eucariótico, levantamos a hipótese de que, por meio de sua atividade exonuclease 5'-3', ele poderia 'perseguir' o último ribossomo de tradução em mRNAs em decaimento cotraducional, semelhante ao XRN1 em levedura5,16. Nossa análise revelou uma periodicidade de 3 nucleotídeos (nt) de contagens de 5'P (Fig. 1a) com uma preferência de 5'P pelo segundo nucleotídeo de cada códon (F1), tanto no nível de metagene quanto no nível de gene único (Fig. 1a e dados estendidos Fig. 1a). Os intermediários da degradação 5'P acumulam 11 e 14 nt a montante dos locais de início e término da tradução, respectivamente, como esperado dos ribossomos de iniciação e terminação lentas. Este padrão é análogo aos locais –14 nt desde o início e –17 nt desde o fim na levedura de brotamento5,15. Esse tamanho de proteção 3 nt menor pode ser explicado pela conhecida diferença nos tamanhos dos ribossomos entre eucariotos e bactérias17. Confirmamos a associação de intermediários de decaimento 5'P com ribossomos de tradução pela aplicação de 5PSeq a frações polirribossomais de gradientes de densidade de sacarose e observamos padrões semelhantes (Dados Estendidos Fig. 1b). Para demonstrar sua origem biológica, confirmamos que a fragmentação in vitro do mesmo RNA eliminou a periodicidade de 3 nt observada in vivo em > 99,5% (sinal da transformação rápida de Fourier (FFT) caindo para 0,11) e por impressões digitais associadas ao início/parada (Fig. .1a). Finalmente, para investigar se há um papel para RNase J neste processo, repetimos a análise em uma cepa de deleção de RNase JA de B. subtilis (rnjA). Isso revelou que a atividade de RNase JA sustenta o padrão de distribuição 5'P observado resultante da degradação de mRNA cotraducional (Fig. 1b).